NP-40裂解液
● 產品包裝：
|
產品編號
|
產品名稱
|
產品包裝
|
說明書
|
|
RL1070
|
NP-40裂解液
|
100ml
|
1份
|
● 產品簡介：
NP-40裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是一種比較溫和的細胞組織裂解液。NP-40裂解液裂解得到的蛋白樣品可以最大限度地保持蛋白的活性狀態（native），可以用于常規的Western、IP和co-IP和ELISA等。NP-40裂解液的主要成分為 Tris(pH7.4)，NaCl，NP-40等。用NP-40裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定樣品的蛋白濃度。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 注意事項：
1. 為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融。可以適當分裝后使用。
2. 需自備蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。
3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。
● 使用說明：
1. 準備即用型裂解緩沖液：
向每1 ml 預冷的裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑（自備）、蛋白酶抑制劑（自備），混勻，冰上預冷待用。注：即用型緩沖液建議現用現配，30分鐘內使用。
2. 細胞總蛋白提取：
2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸，冰上裂解細胞5分鐘，用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續裂解15分鐘，間歇混勻。
|
培養板規格/培養皿表面積
|
細胞量
|
裂解液推薦使用量
|
|
100 mm培養皿
|
1.5×107
|
0.5-1 ml
|
|
60 mm培養皿
|
5×106
|
0.25-0.5 ml
|
|
35 mm培養皿
|
2×106
|
0.2-0.4 ml
|
|
6孔板
|
2.5×106
|
100-200 μl
|
|
24孔板
|
5×105
|
100-150 μl
|
|
96孔板
|
1×105
|
50-100 μl
|
2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用適量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重復漂洗細胞一次；按照細胞沉淀體積（PCM）20 μl加入200 μl 裂解緩沖液的比例加入裂解液，混勻細胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細胞：
裂解混合物超聲波處理（超聲條件根據自有儀器調整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細胞會釋放出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會導致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取得率和純度。研究蛋白互作實驗，如Co-IP，考慮到超聲處理會影響蛋白之間的結合，可以不進行超聲處理。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提取：
3.1 手術切除的組織塊迅速置于預冷的PBS或生理鹽水中，漂洗數次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組織表面液體，將組織切成細小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入即用型裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿后的裂解混合物，超聲波處理（超聲條件根據自有儀器調整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號：PE2719，蛋白提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞。裂解物冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細胞會釋放出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會導致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取得率和純度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
4. 注意事項
4.1 所有的試劑及器具均需預冷后使用,以保持蛋白質的完整性和活性。
4.2 產品中的保存條件及有效期均以未開封情況下計算，為了防止產品與空氣接觸發生化學反應影響產品性能，將未使用完畢的組分按存儲要求保存同時建議開封后的組分盡快使用完畢。
4.3 裂解細胞步驟使用超聲處理或針頭處理極其關鍵，否則蛋白得率會很低。
4.4 一般常規提取的蛋白樣品，進行后續試驗不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白或后續試驗結果不理想，則需要將提取的蛋白樣品進行透析脫鹽。
4.5 提取的蛋白質可以采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（目錄號：RTP7102），由于裂解緩沖液中含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定樣品的蛋白濃度。
4.6 如果用于蛋白質質譜研究，可采用快速蛋白銅染試劑盒（貨號：RTD6207）或快速蛋白鋅染試劑盒（貨號：RTD6206）或快速蛋白銀染試劑盒（貨號：RTD6401）對膠上的蛋白質進行染色，這些染色方法對蛋白質沒有修飾作用，所以對質譜圖沒有影響。對于一般的染色，可以采用FastBlue蛋白染色液（貨號：RTD6202）來染色。
實驗示例：
